conteo celular

Procedimiento usando la cámara de Neubauer, la imagen digital y el procesamiento con ImageJ

1. Capturar la imagen de al menos 5 campos de la cámara de Neubauer (yo uso una Boekel+Co, Hamburg).
2. Alinear y recortar la cuadrícula de 4x4 cuadros: cada cuadro tiene 0.0025 mm2, por lo tanto 0.005 mm (50 um) por lado
3. Guardar la imagen.
4. Abrir la imagen en ImageJ (ver. 1.42q, Wayne Rasband, NIH, USA)
5. Ajustar la escala de medida. Primero usar la herramienta de trazo de línea recta siguiendo la longitud de uno de los cuadros del campo en la imagen y luego calibrar: Menú Analyze-Set Scale; aparece un dialog en el cual hay que anotar la distancia conocida (en imagen bmp de una foto con el objetivo de 40X, la línea es de aprox. 300 pixeles) en mm o en um, la longitud de un lado de cada cuadro es de 50 micrómetros, el el espacio se anota 50 y en unidad um (el programa lo lee como micrómetros).
6. Medir un par de objetos representativos. Con las herramientas de selección de forma (círculo o forma libre, según convenga) ajustar sobre la célula más pequeña, medir usando Ctrl-M o bien Analyze-Measure, y repetir el procedimiento con la célula más grande. En las opciones, ver el cuadro de resultados.
7. Ajustar el formato de la imagen. De ser posible ajustar brillo y contraste hasta convertirla casi en una imagen blanco y negro (no escala de grises) y cambiar el formato a 8 bits (Image-Type-8 bit)
8. Cambiar a formato binario: menú Process-Binary-Make binary
9. Con esta imagen, realzar los objetos a medir/contar usando los comandos Erode, Dilate, Open, Close.
Erode: borra pixeles aislados
Dilate: aumenta pixeles a grupos consistentes de pixeles
Close: cierra figuras con tendencia a ser figuras cerradas, no siempre funciona bien, sirve para rellenar espacios que con el contraste/brillo quedaron con huecos
Open: lo contrario de close, quita grupos de pixeles sospechosos
NOTA: hay que conocer muy bien las características de aquéllo que queremos contar/medir para distinguir en qué casos estamos perdiendo o ganando información. Estos comoandos deben usarse pocas veces, pues se pueden añadir pixeles inexistentes.
10. Contar y medir las células: Analyze-Analyze particles; aparece un dialog en el cual se indican el rango de valores del mínimo al máximo, por ejemplo para bacterias (una vez calibrada la escala de medida) se puede indicar de 1.5-10.0 (las unidades serán de área, en este caso um2). El rango de circularidad conviene que esté en 0.00-1.00, en Show es mejor elegir Outlines, para que tengamos al final una imagen con los contornos para sobreponer e indicar aquéllas células que fueron medidas. Yo selecciono todas las casillas, menos Add to Manager (no sé para qué sirve).

Los resultados pueden ser exportados a Excel o copiados o copiados. Las dos primeras columnas son las más útiles (Area y perimeter), las unidades son las que fueron especificadas en el paso de Set Scale.